访谈摘要
可以预见，使用Quikin CART®技术可以在未来开发出更多基因编辑的、安全有效的CAR-T产品。比如，它可以用于多个免疫检查点敲除增强型CAR-T细胞的制备，可以快速生产通用型CAR-T细胞，可以开发动态调控的安全型CAR-T产品等。——邦耀生物 刘明耀教授
近年来，CAR-T细胞疗法发展迅速，在癌症治疗中显示出巨大潜力。目前，已有8款CAR-T产品获批上市。然而，该疗法仍存在一些局限性，包括复杂的制造工艺、高昂的生产成本、潜在安全性问题等。
在CAR-T的生产中，病毒扮演着重要角色。当前，多数临床试验中批准或研究的CAR-T细胞疗法都是利用病毒载体方法对T细胞进行改造。病毒载体具有高效的基因转导能力和长期的应用历史。然而，病毒载体转导长链基因的能力受到衣壳尺寸的限制，并且涉及病毒的生产条件要求比较严格，从而导致较高的生产成本。更需要关注的是，病毒采用随机插入的方式将CAR序列整合到细胞基因组中，可能会改变正常基因的表达，因此存在潜在的致瘤风险。
尽管一些策略，如转座子系统、mRNA被用来实现使用非病毒载体方法生产CAR-T细胞，但随机整合和无法持久的CAR表达依旧会带来诸如最终产物均一性低等问题。
8月31日，来自华东师范大学生命科学学院张楫钦、刘明耀、杜冰、李大力团队与浙江大学医学院附属第一医院黄河、胡永仙团队以及邦耀生物研究人员合作在Nature上发文，首次报道了一种创新性非病毒定点整合CAR-T技术（Quikin CART®）的开发，及其治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤（r/r NHL）的积极临床试验结果（NCT04213469）。
Quikin CART®可以在不使用病毒载体的情况下，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过一步电转完成CAR序列在T细胞基因组特定位点（PD1）的精确插入，有效解决了目前CAR-T技术的病毒使用和随机整合这两个问题。并且，同时实现CAR稳定表达和PD1基因敲除，可谓一箭双雕。目前，已有多项研究报道利用基因编辑技术可以实现定点整合型CAR-T细胞的制备，但新一代CAR-T技术能否满足大规模工业化制备的要求，临床治疗的安全性和有效性如何还有待更多研究。针对这些问题，研究人员首先探索和优化了制备方法，包括模板设计、细胞状态等方面的条件和参数，成功开发了非病毒定点整合CAR-T技术。鉴于报道证明阻断 PD1/PD-L1 通路可提高 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性，研究人员又制备了靶向CD19非病毒PD1定点整合CAR-T细胞（PD1-19bbz）。小鼠体内实验显示，相比于其他组，PD1-19bbz无论在PD-L1高表达还是低表达的肿瘤细胞中，都体现出更强大、更持久的杀伤效果，小鼠生存率得到显著提高（下图）。这提示PD-1下调与非病毒定点整合CAR-T细胞制备方法可以联合提高CAR-T细胞的抗肿瘤功能。
在临床前实验数据的基础上，研究人员随后进行了研究者发起的临床试验（IIT），以评估 PD1-19bbz 细胞治疗 r/r
B-NHL 患者的安全性和有效性。在接受治疗的8例患者中，未观察到CAR-T治疗相关的神经毒性和2级以上的细胞因子风暴。此外，检测结果显示PD1-19bbz回输后能在体内快速扩增并维持较长时间。接受治疗后，有87.5%（7/8）的患者获得了疾病完全缓解（CR）的效果，所有患者均对治疗响应，客观缓解率（ORR）为100%，其中有5例患者响应时间超过1年（下图）。迄今，接受该CAR-T疗法的患者无癌生存期最长已超2年，目前仍处于疾病完全缓解的状态。
来源：Nature
值得一提的是，无论是针对PD-L1高表达肿瘤患者的治疗，还是在CAR-T细胞回输剂量和阳性率较低的条件下，PD1-19bbz均显示出良好的疗效，证明了其具有强大的肿瘤杀伤能力。
总结来说，这项研究报道的Quikin CART®技术结合了非病毒制造工艺和精准基因组编辑的优势，具有先进性。作为一种不使用病毒的二合一方法，其简化了制造过程，缩短了制备时间，降低了生产成本，提高了CAR-T细胞产品的安全性和有效性。此外，位点特异性整合增强了CAR-T细胞的均一性，并使开发多功能细胞产品成为可能。重要的是，研究还展示了该技术临床应用的可行性，并在临床试验中证明了其较高的安全性和有效性。这项CRISPR–Cas9介导的非病毒、基因特异性靶向技术，突破了当前CAR-T疗法的重大障碍，在细胞治疗中显示出巨大潜力。
据最新消息，9月16日，邦耀生物利用具有自主知识产权的Quikin CART®平台开发的名为“靶向CD19非病毒PD1定点整合CAR-T细胞注射液”（管线代号：BRL-201）的临床试验申请（IND），正式获得CDE受理，受理号：CXSL2200465国。
刘明耀教授，美国马里兰大学细胞生物学博士，美国约翰-霍普金斯大学医学院和加州理工学院生物学部博士后。华东师范大学生命医学研究所所长，上海市调控生物学重点实验室主任。曾任美国德州农工大学生物科学与技术研究所终身正教授，博导；美国德州大学休斯顿医学院，德州大学MD Anderson肿瘤中心博导。
刘明耀教授致力于G蛋白偶联受体（GPCR）在个体发育和重大疾病发生发展中的功能、机理及靶向药物研发，同时在基因编辑和细胞治疗的技术应用转化中做出卓越研究。已在 Science、Nature、PNAS 等国际知名学术刊物上发表 SCI 论文 400 多篇，申请专利 200 多项，授权80 余项。获得国家科学技术进步一等奖，上海市科技进步一等奖，上海市白玉兰纪念奖等。
1、原创非病毒定点整合CAR-T技术（Quikin CART®）的开发思路传统CAR-T产品的制备主要通过使用病毒载体来实现，这一方面对病毒制备工艺提出了很高的要求，另一方面大大增加了CAR-T细胞的生产成本（上市产品定价在40万美元左右）。此外，由于病毒采用随机插入的方式将CAR序列整合到细胞基因组中，可能会改变正常基因的表达，因此存在潜在的致瘤风险。由于几乎每个CAR-T细胞都具有不同的CAR插入位点或拷贝数，所以通过这种方式制备获得的CAR-T产品是很不均一的。从生产工艺来看，传统CAR-T产品的制备时间较长（上市产品平均超2周）， 极大增加了患者等待用药的时间，不适用于肿瘤进展非常快的患者。此外，如果需要制备基因修饰的CAR-T细胞，往往需要多步操作，工艺相对复杂。针对这些CAR-T治疗领域的痛点，结合我们自身在基因编辑技术上的特长和优势，我们思考了如何利用基因编辑技术来解决这些问题，即为这项研究的出发点。通过对现有CAR-T技术的深入剖析，我们发现使用病毒载体和存在随机插入是导致上述问题的重要原因。因此，如果能开发一种不使用病毒且能实现CAR定点整合的新技术，那就能有效解决目前CAR-T治疗领域存在的问题，是一个具有巨大潜力的发展方向。Quikin CART®技术可以同时有效解决使用病毒和随机插入这两个问题，一方面使用非病毒生产工艺可以极大减少因使用病毒载体带来的高昂成本，另一方面定点整合可以保证每个CAR序列都能精确地插入到基因组的特定位点，避免了随机插入导致的致瘤风险，也最大程度保证了CAR-T产品的安全性和有效性。此外，Quikin CART®技术只需一步即可完成基因编辑CAR-T细胞的制备，同时实现CAR的持续性表达和T细胞内源基因的调控，这大大缩短了整个CAR-T产品的制备时间，得以让更多患者受益。我们知道，想要在细胞中实现外源长片段序列的定点整合是一件非常困难的事情。根据以往报道，在不同类型细胞中精确整合的效率一般只有1%~10%。如何提高T细胞中CAR序列定点整合的效率是我们面临的第一个困难。另外，由于需要通过电转的方式在细胞膜上打孔导入基因编辑工具，而电击会对细胞造成较大的损伤，因此如何进行精细化的细胞编辑也是非常重要的。我们从载体类型、模板设计、细胞状态等方面开展了全面系统的研究，通过各种条件摸索和参数优化，在做了大量的对比研究后，最终确定了最佳的制备方法，为本研究的开展奠定了重要基础。第二个难点是将来自实验室的小规模科研级技术方法转移到生产车间成为大规模工业级的生产工艺。由于两者的要求截然不同，这个过程也花费了我们大量的时间和精力。我们开展了很多的工艺研究，去进行制备工艺的优化。第三个难点是临床试验，包括当时正值疫情爆发，临床试验的顺利开展面临着很大挑战。值得自豪的是，我们的合作团队克服了重重困难，在短时间内开展了高质量的临床试验，对本研究的顺利完成给予了巨大帮助。3、Quikin
CART®技术对CAR-T研发带来的影响Quikin CART®技术能有效解决目前CAR-T治疗领域存在的痛点，相比于其他现有CAR-T技术，具有生产成本低、制备时间短、工艺简单、产品均一性高等优点，能有效增强CAR-T细胞临床治疗的安全性和有效性。从研发角度来看，Quikin CART®技术使得CAR-T细胞的精准化、多样化改造成为可能。可以预见，使用Quikin CART®技术可以在未来开发出更多基因编辑的、安全有效的CAR-T产品。比如，它可以用于多个免疫检查点敲除增强型CAR-T细胞的制备，可以快速生产通用型CAR-T细胞，可以开发动态调控的安全型CAR-T产品等。Quikin CART®技术总体来看有以下4大可优化的方向：1）虽然进行了大量优化，我们已经显著提高了CAR定点整合的效率，但总体来看，Quikin CART®的效率与传统慢病毒制备工艺相比还是存在一定的距离。而且，进一步地提高CAR定点整合率也有助于多基因编辑CAR-T产品的开发和应用。因此，如何结合更多新兴的生物学技术、采用不同的方法和思路去进一步提高定点整合率是一个努力的方向。2）目前该技术对于更长片段外源序列整合的效率还比较低，如果能实现长片段序列的整合，那将进一步提高CAR-T细胞的改造空间。3）随着物料、仪器设备的不断改良，Quikin CART®技术的工业级制备工艺还有待进一步的优化。4）非病毒定点整合技术还可拓展到除T细胞以外其他类型细胞产品的开发上，为研发更多精准化、多样化改造的细胞治疗药物提供可能。首先，我们正在积极布局Quikin CART®技术用于治疗实体瘤CAR-T产品的开发，期望发挥Quikin CART®技术可实现多样化改造的优势，在保证安全性的前提下，开发出更多强大有效的CAR-T产品，以解决实体瘤治疗难的世界难题。另外，除了PD1位点，我们还在开发更多位点、更多基因编辑的Quikin CART产品，以全方位地提高CAR-T细胞的功能。最后，我们也在不断地进行技术迭代和升级，期望在不久的将来开发出一个更高级、更强大的Quikin CART®技术平台。自2017年FDA批准首款CAR-T上市以来，CAR-T疗法一直维持着超高的研发热度。展望未来3–5年，该领域有望取得以下突破：1）在血液肿瘤治疗中，随着更多临床试验的开展，CAR-T疗法有望不断前移，将来有望成为一线、二线标准疗法，惠及更多患者；2）异体通用型CAR-T技术会得到快速发展，有望实现临床突破；3）CAR-T治疗会逐步拓展到除肿瘤之外更多其他适应症的治疗，比如自身免疫性疾病等；4）基因编辑等新兴生物学技术与CAR-T技术的结合会更加紧密，有望诞生更多先进性的、与CAR-T相关的新技术；5）随着CAR-T技术本身的发展，包括靶点开发、产品开发等以及临床治疗方案的探索和深入研究，CAR-T疗法有望在实体瘤治疗中取得重大突破；6）随着CAR-T及周边行业的发展，CAR-T产品的成本有望逐步下降，大幅度提高细胞治疗产品的可及性。参考资料：
1# Jiqin Zhanget al. Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and
efficacy in B-NHL. Nature. (2022)
2# 领跑全球！中国CAR-T成果首登Nature，邦耀生物全新一代Quikin CAR-T取得重大突破（来源：邦耀生物官微“邦耀实验室”）
3# 世界首个非病毒PD1定点整合CAR-T产品国内IND获得受理（来源：邦耀生物官微“邦耀实验室”）